小罗开讲 | 数字PCR之“分”而治之纳米微孔对dPCR定量结果的影响

转自罗氏诊断生命科学公众号

大家好，本堂课小罗将跟大家分享数字PCR之“分”而治之纳米微孔对dPCR定量结果的影响。

1999年 “数字PCR”（Digital PCR，dPCR）的概念被第一次提出，至今已有十几年的时间。现如今大多数科学工作者对数字PCR的概念已不再陌生。就其本质，可以归结为“分而治之”（divide and conquer）^【1】：通过将一份qPCR体系分配成大量纳米微孔之后，再进行单独、平行的PCR扩增。由于每个纳米微孔中包含或者不包含目标分子（DNA模板），因此在PCR扩增结束后，通过对每个纳米微孔荧光信号的统计学分析，就可以实现对整个反应体系中模板分子的绝对定量。

dPCR是“分而治之”的过程，“分”是技术关键，而分成多少个纳米微孔正是困扰实验者的首要问题。

应该分成多少个纳米微孔？

首先需要明确纳米微孔的数量

是如何影响dPCR的定量结果。

dPCR采用直接计数的方法进行定量分析，即在PCR扩增结束后，将有荧光信号的纳米微孔记为1，无荧光信号记为0（定量是二进制的，因此称为“数字”）。有荧光信号的微孔说明至少含有一个拷贝的目标分子。在目标DNA浓度极低的情况下，理论上可以认为有荧光的纳米微孔数目就等于DNA分子的拷贝数，但通常情况下，数字PCR的纳米微孔中可能会包含两个甚至更多的目标分子，因此需要采用泊松概率分布公式来进行计算：

λ = −ln (1 − p)

λ：每个微孔的目标分子的平均数量

p：具有正信号的纳米微孔数量与微孔总数的比值。

可以使用λ计算出目标分子的绝对数量^【2】，很明显，微孔数越多，检测的动态范围就越广^【3】。

图1的泊松概率分布曲线图更直观地体现了这一点：

图1. 由微孔预测目标分子数

（图片来源：罗氏诊断整理）

如图1显示，随着阳性微孔比例（p）的增加，体系中目标分子的平均拷贝数会有较大的差距，随着p的持续增加，dPCR结果的不确定度也随着提高。总体来说，dPCR阳性微孔数量不得超过总微孔数量的80%，总反应微孔数的增加提高的是dPCR检测的线性范围。

在传统模拟分析中，测量的不确定度通常受检测仪器分辨率的限制，例如，荧光检测器分辨荧光信号微小差异的能力。但在dPCR 检测中，检测仪器只需要识别每个纳米微孔是否有0个或大于1个目标分子，因此dPCR的数据分析较少依赖于检测器的特性。排除了检测器对dPCR定量结果的影响，那么下一个需要明确的信息是什么呢？

需要明确的是

引起dPCR偏差的来源有哪些。

dPCR主要有2个引起偏差的来源，分别是：二次采样误差和分区误差。二次采样过程引入了不可避免的误差源，尤其是当原始样本中要检测的目标很少时，设定了检测下限，仪器本身能兼容的二次采样体积越大，一定程度上能提高检测的灵敏度。

根据泊松分布原理，阳性微孔比例不超过80%，所以分区误差在原始样本浓度较高的情况下占主导地位。在一组重复实验中，若信号为0的微孔数量存在差异，该差异会引起总反应体系中目标结果计算的差异。根据 Dube 等人的分析，可以找到对分区误差的计算方式^{【4】【5】}，根据该计算方式我们可以比较不同纳米微孔数量下的分区误差^【6】。

图2比较了20,000个微孔和1,000,000个微孔的二次采样和分区误差与样本浓度的关系。在dPCR中，通常将每个纳米微孔中的模板拷贝数λ的范围调整到0.001到6^【4】（在某些情况下，可以高达8^【7】）。在纳米微孔N为1,000,000时，分区错误显著下降到<3%，说明微孔数量越多，越能降低分区误差，从而提高dPCR的检测准确度。

图2 . ( A ) 20,000 个分区和 ( B ) 1,000,000个微孔的

二次采样和分区误差与样本浓度的关系

（图片来源：罗氏诊断整理）

由dPCR定量的原理分析得出，“分”成的纳米微孔数量与定量结果的准确性和检测范围紧密相关，总结下来就是：微孔越多，dPCR结果越准确，动态范围越广。

虽然现有数字PCR系统在实践中采用稀释样品的方式来避免微孔不够的问题，但这也限制了数字PCR的实际性能。因为更多的分区数量才能检测到更多的野生型核酸，从而才能检出更低频率的变异。

参考文献：

1. M Baker nature methods |VOL.9 NO.6 |JUNE 2012 | 541-544

2. Brunstein J (2013) Digital PCR: theory and applications. MLO Med Lab Obs 45:34–35

3. Hindson BJ, Ness KD, Masquelier DA et al (2011) High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem 83:8604–8610

4. Bizouarn, F. In Quantitative Real-Time PCR; Biassoni, R., Raso, A., Eds.; Methods in Molecular Biology; Springer: New York, 2014; Vol. 1160, pp 27–41.

5. Dube, S., Qin, J., Ramakrishnan, R. Mathematical Analysis of Copy Number Variation in a DNA Sample Using Digital PCR on a Nanofluidic Device. PLoS One 2008, 3 (8), e2876.

6. Digital Assays Part I: Partitioning Statistics and Digital PCR，Vol 22, Issue 4, 2017

7. Morley, A. A. Digital PCR: A brief history. Biomol. Detect. Quantif. 2014, 1 (1), 1–2.